Microscopia a forza atomica AFM

La microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica di imaging ad alta risoluzione che permette di ottenere immagini di una superficie grazie alla scansione di una punta posta all’estremità di una micro-leva (cantilever). Il funzionamento dell’AFM si basa sull’interazione tra la sonda e la superficie del campione e permette di ottenere immagini tridimensionali con risoluzione nanometrica o addirittura su scala atomica. L’interazione della punta con la superficie del campione provoca una deflessione del cantilever che viene rilevata tipicamente da un sistema ottico e, attraverso un circuito di feed-back, l’altezza del cantilever viene regolata per far sì che il sistema tracci il profilo topografico della superficie.

La microscopia a forza atomica presenta numerosi vantaggi rispetto alle tecniche di imaging tradizionale e, fin dalla sua invenzione nel 1986, rappresenta un potente strumento per la caratterizzazione di materiali di qualsiasi composizione. In particolare:

• non essendo basata sull’interazione tra il campione e una radiazione elettromagnetica la tecnica non è soggetta al “limite di diffrazione” e può raggiungere una risoluzione molto più bassa (tipicamente 2-3 ordini di grandezza) rispetto alle tecniche di microscopia ottica ed elettronica. Sono infatti numerosi gli esempi in letteratura in cui viene raggiunta una risoluzione atomica su campioni di diversa natura;

Figura 1. Sinistra: risoluzione atomica della calcite in modalità tapping. Questa immagine di fase (scansione= 15 nm x 15 nm) è stata acquisita in acqua con un’ampiezza di oscillazione sub-nanometrica. Immagine realizzata con un Cypher AFM. Destra: immagini topografiche successive acquisite in modalità tapping di un cristallo di calcite in acqua. I difetti puntiformi ripetuti dimostrano le reali capacità di risoluzione atomica dell’AFM Cypher. Le frecce indicano la direzione di scansione. Dimensione di scansione 20 nm; scala Z 3,2 Å; ampiezza del cantilever 4 Å; frequenza del cantilever 454 kHz.

• la preparazione del campione per un’analisi AFM è quasi del tutto assente in quanto non sono necessarie operazioni di metallizzazione o labelling, ma è sufficiente depositare o fissare il campione su una superficie. Inoltre, è possibile effettuare misure AFM anche in liquido o in ambiente nativo e questa caratteristica è particolarmente utile per l’analisi di campioni biologici (e non solo) in condizioni reali;
• l’AFM è l’unica tecnica microscopica che permette di misurare direttamente l’altezza (o la rugosità) di un campione senza ricostruzioni software e con un’elevata risoluzione.

Oltre al tradizionale sistema di rivelazione mediante OBD optical beam deflection, gli AFM sella serie VERO di Asylum Research Oxford Instruments presentano un innovativo sistema di rivelazione interferometrica differenziale che consente di misurare il reale spostamento del cantiliver senza interferenze dovute all’interazione tra la superficie e la punta.

• l’AFM consente di misurare, oltre alla topografia del campione fino alla scala atomica, diverse proprietà chimico-fisiche in base alla modalità di analisi scelta quali, ad esempio, proprietà nano-meccaniche, proprietà termiche, conducibilità elettrica, proprietà piezolettriche, ecc. Inoltre, l’AFM consente anche la manipolazione del campione su scala sub-nanometrica, utilizzando ad esempio la punta per spingere e posizionare oggetti, o per creare incisioni e pattern specifici attraverso tecniche di nanolitografia;

Figura 2. Elenco delle modalità di misura disponibili sugli AFM della serie Cypher e MFP-3D.

Figura 3. Esempi di nanolitografia: nell’immagine a sinistra il logo di Asylum Research è stato ricavato per ossidazione anodica su un substrato di silicio con l’AFM Cypher ES (Tip bias -1V/+8V, modalità in contatto, scansione di 10 µm); l’immagine a destra invece è stata ricavata incidendo una superficie di policarbonato (scansione 14 µm).

Componenti principali di un AFM e principio di funzionamento

Una tipica configurazione di un AFM prevede:

• un cantilever alla cui estremità è fissata una punta affilata, spesso realizzata in silicio o nitruro di silicio: la punta interagisce con la superficie del campione mentre il cantilever si piega in risposta alle forze tra la punta e il campione;
• un porta campione;
• un sistema di posizionamento (attuatore piezolettrico) che permette di muovere nelle 3 direzioni il campione relativamente alla punta (a seconda del tipo di AFM si possono avere configurazioni tip scanning, sample scanning o split scanning);
• un sistema di rivelazione ottico che permette di misurare l’angolo di deflessione del cantilever, che viene successivamente convertito in un segnale elettrico proporzionale allo spostamento in x,y e z del cantilever;
• un sistema piezoelettrico che permette di far oscillare il cantilever alla sua frequenza di risonanza (per analisi in modalità “tapping” o in “non contatto”);
• un controller che permette di elaborare i segnali e di ricostruire la topografia del campione analizzato.

Tipicamente, durante una misura di topografia AFM si utilizza un circuito a retroazione (feedback loop) per mantenere costante la forza tra la sonda e il campione; finché la punta rimane a contatto con il campione e la superficie viene scansionata nel piano x-y, le variazioni di altezza del campione modificano la deflessione del cantilever e il circuito di retroazione regola quindi l’altezza del supporto della sonda in modo da riportare la deflessione al valore definito dall’utente (setpoint). In questa situazione (constant height mode), il segnale in uscita dal circuito di retroazione corrisponde alla topografia della superficie del campione. A seconda del tipo di esperimento, può essere utile mantenere costante la deflessione del cantilever invece che la distanza tra la punta e il campione (constant deflection mode) oppure lavorare in modalità dinamica facendo oscillare il cantilever ed utilizzare l’ampiezza di oscillazione (o la fase) come parametro di controllo nel circuito di feedback.

Figura 4. Rappresentazione schematica dei componenti principali di un microscopio a forza atomica.

I cantilever e le punte utilizzate nei microscopi a forza atomica rivestono un ruolo importante e vanno accuratamente selezionati sulla base del tipo di campione analizzato e del tipo di analisi che si desidera effettuare. Per maggiori informazioni visita la sezione dedicata agli AFM probes sul sito di Oxford Instruments Asylum Research.

Il cantilever reagisce alle variazioni delle proprietà locali del campione (differenze fisiche, chimiche e topologiche) sotto la punta di misura con una variazione della deflessione, che viene tipicamente rilevata mediante un sistema ottico (optical beam deflection, OBD). Un raggio laser è focalizzato sul lato posteriore del cantilever e viene riflesso su un foto-rivelatore sensibile alla posizione (PSPD). Il PSPD è un fotodiodo a quattro segmenti, in cui la luce in ingresso crea una corrente elettrica in ciascun segmento. La somma dei segnali dei singoli segmenti determina la deflessione laterale e verticale del cantilever.

Gli AFM della serie Vero sono gli unici strumenti sul mercato che possiedono l’innovativo sistema di rivelazione basato sulla interferometria differenziale in quadratura di fase (QDPI). Questa tecnica brevettata da Asylum Research Oxford Instruments ridefinisce il concetto stesso di AFM e spinge ulteriormente le frontiere della ricerca nel campo della microscopia a forza atomica

Scarica la nota applicativa: Quadrature Phase Differential Interferometry (QPDI) technology in the Asylum Research Vero AFM.

Modalità operative AFM

Le diverse modalità operative dell’AFM sono progettate per ottimizzare la misurazione delle forze in base alla natura del campione e all’informazione desiderata.

Nella modalità contatto (contact mode AFM) la punta mantiene un contatto fisico con la superficie e il cantilever subisce una deflessione a causa di forze attrattive o repulsive a corto raggio; una delle maggiori limitazioni della modalità in contatto è la possibilità di causare danni al campione (o alla punta) e il fatto che può essere usata solo per misure AFM statiche (es. topografia, analisi curve forza-distanza, nano-indentazione). Nella modalità in non-contatto (non-contact mode AFM) o in contatto intermittente (tapping mode AFM) il cantilever viene fatto oscillare intorno alla sua frequenza di risonanza e la punta si trova mediamente ad una distanza maggiore dal campione, sfruttando interazioni anche a medio-lungo raggio. Questa modalità di AFM dinamica permette l’analisi di campioni soffici o delicati e consente di ottenere anche informazioni sulle proprietà viscoelastiche del campione.

Diverse altre modalità operative sono disponibili sui microscopi a forza atomica, tra le quali:

• piezoresponse force microscopy (PFM) in cui una punta conduttiva viene mantenuta in contatto con una superficie piezoelettrica o ferroelettrica e, in seguito all’applicazione di una corrente alternata, viene misurata la deformazione del campione;
• conductive atomic force microscopy (CAFM) in cui viene misurata la corrente elettrica che passa attraverso una punta conduttiva posta in contatto con il campione oppure vengono generate in punti specifici della superficie;
• scanning tunneling microscopy (STM) in cui l’immagine del campione viene ricostruita misurando la corrente di tunneling ad altezza costante, ma si può operare anche a corrente costante o facendo scansioni I-V
• electrochemical atomic force microscopy (EC-AFM) in cui la topografia del campione viene misurata (in tapping mode) all’interno di una cella elettrolitica con 3 elettrodi, in funzione del potenziale applicato;
• Kelvin probe force microscopy (KPFM) in cui viene mappata la differenza di potenziale tra la superficie del campione ed una punta conduttiva. Questa tecnica è utilizzata per misurare la work function, ovvero l’energia necessaria per l’estrazione di un elettrone da un metallo o da un semiconduttore;
• magnetic force microscopy (MFM) in cui una punta magnetizzata scansiona la superficie del campione per ricostruirne la struttura magnetica;
• lateral force microscopy (LFM) usata per studiare le proprietà tribologiche del campione in cui la punta scansiona (in modalità contatto) in direzione ortogonale all’asse del cantilever, misurandone la torsione.

Tipiche analisi meccaniche alla nano-scala

Le proprietà meccaniche su scala nanometrica influenzano il comportamento e le prestazioni di innumerevoli materiali. Lo studio di tali proprietà contribuisce sia alla comprensione teorica di molti fenomeni chimico-fisici, che allo sviluppo di applicazioni commerciali. Si trovano esempi in tutte le discipline, dalla scienza dei materiali dove il modulo elastico influisce sull’affidabilità dei film dielettrici nano-porosi nei semiconduttori, fino alla biologia in cui sono state osservate relazioni tra la rigidità di cellule tumorali e il loro potenziale metastatico.

Sulla base della modalità AFM (es. statica vs dinamica) e sulle proprietà meccaniche del campione da analizzare (es. rigido vs soffice) diverse tipologie di analisi sono disponibili, tra le quali:

• Curve di forza acquisite abbassando la punta AFM fin quando questa non entra in contatto con il campione, deformando o indentando la superficie, e successivamente alzando il cantilever fino alla perdita di contatto tra la punta e il campione. La deflessione del cantilever in funzione della distanza viene poi convertita in un segnale di forza, nota la costante elastica del cantilever stesso. Le curve di forza possono essere acquisite su un punto della superficie o su una matrice 2D di punti e in questo caso si parla di mappe di forza (force maps) o di curve forza-volume (force volume AFM);

Figura 5. Mappe di forza su cellule di neuroni corticali per studiare la variazione dell’elasticità con la temperatura. (in alto) Esempio di curva di forza di una cellula a 25 ºC (sinistra) e 37ºC (destra). (in basso) Istogrammi del modulo elastico della cellula ottenuti da mappe di forza 16 µm × 16 µm. Esperimenti eseguiti in liquido sull’AFM MFP-3D equpaggiato con stage BioHeater. Immagine adattata da E. Spedden, D.L. Kaplan, and C. Staii, Phys. Biol. 10, 056002 (2013).

• Phase imaging in cui la variazione di fase durante l’oscillazione del cantilever (tapping mode) viene utilizzata per monitorare le proprietà meccaniche del campione. Il segnale di ampiezza dell’oscillazione del cantilever viene registrato simultaneamente al segnale in fase permettendo così di correlare direttamente proprietà adesive, proprietà viscoelastiche, rigidità del campione, ecc. con l’immagine topografica della superficie;

Figura 6. Cristalli di polipropilene sindiotattico a 80°C: immagine topografica (sx) e in fase (dx). Asylum Research Learning Centre (oxinst.com)

Figura 7. Ricostruzione 3D dell’immagine topografica sovrapposta al segnale di fase di un copolimero SEBS (stirene-etilene-butilene-stirene) depositato su un wafer di silicio, campione per gentile concessione di R. Segalman e A. Hexemer, Kramer Group, UCSB. Asylum Research Learning Centre (oxinst.com)

• Loss tangent imaging in cui si misura il rapporto tra l’energia dissipata e l’energia immagazzinata per ogni ciclo di deformazione periodica della punta (, determinato dall’ampiezza e dalla fase della risposta in tapping mode. Questa tecnica di imaging permette di differenziare campioni che non presentano un sufficiente contrasto di topografia o di fase;

Figura 8. Loss tangent (tan δ) imaging di un sacchetto di caffè commerciale in sezione trasversale. Le caratteristiche del campione, tra cui gli strati barriere al vapore, gli strati di “legatura” e lo strato metallico sono chiaramente distinguibili; dimensione della scansione 15 μm, ricostruzione 3D di un immagine acquisita con AFM Cypher S.

Per approfondire visita il sito AFM Imaging | Nanotechnology Tools (oxinst.com)

Esempi applicativi

1. Il campione è un wafer di carburo di silicio (SiC) su cui è stato fatto crescere per epitassia uno strato di nitruro di gallio (GaN). Lo scopo dell’analisi è studiare i difetti epitassiali causati da dislocazioni nel substrato SiC che si propagano attraverso la crescita epitassiale causando difetti quasi esagonali nello strato di GaN (spesso chiamati micropipe). Autori: Luca Buccini , Anacleto Proietti , Prof. Daniele Passeri, and Prof. Marco Rossi, Sapienza Università di Roma | https://afm.oxinst.com/afm-gallery/view/757/the-sinkhole-at-antelope-canyon
2. I domini ferroelettrici triangolari di un campione di nitruro di boro distorto presentano una polarizzazione in piano lungo le pareti del dominio. Questa componente di polarizzazione in piano è osservabile nella modalità Vector PFM; il segnale di ampiezza assomiglia a fiori di narciso disposti in modo esagonale. Autore: Lu Ming, Shanghai Tech University | AFM Image Gallery: Ferroelectric Narcissus​ (oxinst.com)
3. Mappa del modulo elastico ottenuto in modalità AM-FM di un cristallo di Tulipalin A preparato per polimerizzazione in emulsione. Autori: Anton Popelka, Jozef Kollar, Peter Kasak, Qatar University | AFM Image Gallery: Polymer crystal based on Tulipalin A (oxinst.com)
4. Grafene impilato su grafene utilizzando acqua su un substrato di SiO₂. Autori: Dr. Rakesh Sharbidre, Dr. Seong-Gu Hong, Dr. Byong Chon Park, Korea Research Institute of Standards and Science (KRISS) | AFM Image Gallery: Graphene-Graphene Homostructure Stacking (oxinst.com)
5. Cellulosa vegetale analizzata in modalità tapping. L’immagine dell’errore/ampiezza mostra l’assemblaggio gerarchico della cellulosa vegetale, da nanofibrille larghe 3 nm fino a microfibrille larghe 10 nm e fasci larghi 50-200 nm. Autore: Mouhanad Babi, McMaster University | AFM Image Gallery: Plant Cellulose (oxinst.com) | Efficient Labeling of Nanocellulose for High-Resolution Fluorescence Microscopy Applications | Biomacromolecules (acs.org)
6. Film sottile di polimero PVDF-TrFE depositato con tecnica Langmuir-Blodgett (LB). Autori: Somnath Kale, Rohit Soni, Indian Institute of Science Education and Research Berhampur | AFM Image Gallery: PVDF-TrFE Polymer Thin Film (oxinst.com)

Referenze:

https://afm.oxinst.com/products/vero-family-afms/vero-afm

https://afm.oxinst.com/application-detail/afm-for-nanomechanical-measurements

https://afm.oxinst.com/afm-gallery/

https://interaktiv.chemie.uni-mainz.de/vpcf1/afm-man.en.html