Separazione
La tecnica GPC/SEC è una tecnica di separazione fisica utilizzata per la misura della distribuzione dei pesi molecolari di campioni macromolecolari, materiali polimerici o proteine. La separazione avviene all’interno di una colonna cromatografica costituita dalla fase stazionaria, un supporto inerte con pori di dimensioni controllate. Attraverso la colonna eluisce la fase mobile, ovvero un solvente organico o acquoso, nel quale viene disperso il campione.
A differenza di altre tecniche cromatografiche come ad esempio l’HPLC, in SEC/GPC non ci sono interazioni di tipo chimico o ionico con la fase stazionaria nella colonna. La tecnica si basa esclusivamente sul principio di separazione fisica in funzione della dimensione o volume molecolare, generalmente proporzionale al peso molecolare. Il campione che passa attraverso la colonna subisce un rallentamento proporzionale alle dimensioni delle macromolecole e alle dimensioni dei pori. L’ordine in uscita andrà dalle molecole di dimensione maggiore – che non passano attraverso i pori e quindi escono rapidamente – a quelle di dimensione inferiore, le quali penetrano i pori della fase stazionaria e quindi impiegheranno un tempo maggiore a percorrere la colonna.
In SEC/GPC, la separazione avviene in base alla dimensione, non in base al Peso molecolare. Nella maggior parte dei casi, la dimensione molecolare è proporzionale al peso molecolare.
In SEC/GPC, è necessaria una sola pompa poiché la viscosità dell’eluente va mantenuta costante; Non si usano gradienti di solventi. Vari tipi di detectors possono essere collegati in uscita della colonna per la caratterizzazione della distribuzione dei pesi molecolari del campione.
Detectors
Per caratterizzare il peso molecolare delle varie popolazioni eluite, si collegano dei detectors in uscita della colonna. Essi possono essere di natura diversa, singoli o multipli a secondo del tipo d’informazione ricercato e della calibrazione scelta per la colonna (vedere qui sotto).
Possiamo classificare i vari detectors come segue:
- detectors di concentrazione: Indice di rifrazione, UV (1 lunghezza d’onda), PDA/DAD (Photodiode array)
- detector di viscosità
- detector di light scattering: Low Angle Light Scattering, Right Angle Light Scattering, MultiAngle Light Scattering, Dynamic Light Scattering
Il campione, all’uscita della colonna SEC/GPC può essere caratterizzato da un unico detector di concentrazione (calibrazione di tipo convenzionale della colonna), o da una serie di detectors:
- detector di concentrazione + detector di viscosità (calibrazione detta ‘Universale’ della colonna)
- detectors di concentrazione + light scattering + viscosità (Triple detection – misura del peso moleclare assoluto)
Una separazione SEC/GPC con triple detection consente di ottenere la distribuzione dei pesi molecolari assoluti, delle dimensioni molecolari, della viscosità intrinseca e varie informazioni sulla struttura macromolecolare come conformazione, aggregazione e branching.
Calibrazione
Sola la combinazione di un detector di concentrazione con un detector di Light scattering consente la misura del peso molecolare assoluto del campione. Senza detector di Light Scattering si ottiene un peso molecolare relativo grazie alla calibrazione della colonna SEC/GPC. Il metodo di calibrazione si basa sulla creazione di curve di taratura attraverso standard di polimeri o proteine a peso noto e su una successiva analisi per confronto. Esistono 2 tipi di calibrazione: convenzionale ed Universale.
Triple Detection (Peso Molecolare Assoluto)
La triple detection è il metodo di riferimento per la caratterizzazione dei polimeri sintetici o naturali e delle proteine con la SEC/GPC. Il metodo consiste nell’associazione di 3 detectors – un detector di concentrazione, un detector di viscosità e un detector di light scattering – che forniscono informazioni diverse e complementari:
- il detector di light scattering fornisce il peso molecolare assoluto senza la necessità di calibrare la colonnail
- il detector di viscosità misura la viscosità intrinseca (inverso della densità) e consente la determinazione della dimensione molecolare, della conformazione e della struttura
- un detector UV o indice di rifrazione fornisce la concentrazione, necessaria sia alla determinazione del peso molecolare che alla viscosità.
La triple detection necessita solo della misura di un singolo standard di peso molecolare per la determinazione della costante strumentale*.
La triple detection consente una caratterizzazione completa ed accurata del campione grazie alla determinazione del peso molecolare, della dimensione molecolare (al di sotto di 1 nm), della viscosità intrinseca, del raggio idrodinamico e del raggio di girazione ma fornisce anche informazioni strutturali sulla conformazione, il branching o l’aggregazione in un unico esperimento SEC/GPC.
Calibrazione Convenzionale
La calibrazione della colonna viene effettuata grazie all’uso di un unico detector di concentrazione, UV o indice di rifrazione e di una serie di standards di peso molecolare noto. La colonna SEC/GPC separa i campioni in funzione del loro volume idrodinamico (dimensione), ogni campione ha un tempo di eluizione proprio corrispondendo alla sua dimensione, e quindi al suo peso molecolare. Con gli standards si costituisce una retta di calibrazione log Mw vs. Volume eluizione, che ci consente di determinare il peso molecolare di un campione ignoto conoscendo il suo volume di eluizione in questa colonna specifica (volume corrispondente al picco nel segnale UV o RI).
I pesi molecolari degli standards devono coprire il range di pesi molecolari della distribuzione del campione da analizzare.
Attenzione: la calibrazione convenzionale assume che il campione analizzato abbia la stessa densità degli standards usati per la calibrazione della colonna. Si usano degli standards di proteine per l’analisi di campioni biomolecolari e standards polimerici di varie nature per l’analisi di polimeri. Gli standards devono quindi essere di stessa natura chimica e avere la stessa struttura (lineare, globulare, etc.). Sfortunatamente, non sempre esistono gli standards di stessa densità del campione da analizzare, in quel caso il peso molecolare relativo ottenuto non è accurato. La calibrazione Universale risolve questo problema.
Calibrazione Universale
In questo caso la calibrazione della colonna viene effettuata grazie all’uso di 2 detectors: un detector di concentrazione (UV o IR) in associazione con un detector di viscosità, e di una serie di standards di peso molecolare noto, di qualsiasi natura dal momento che coprono il range di pesi molecolari d’interesse.
In effetti, siccome una colonna SEC/GPC separa i campioni in base al loro volume e non al loro peso molecolare, per essere indipendenti dalla natura degli standards di calibrazione si costituisce una retta di calibrazione del volume idrodinamico (e non più il peso molecolare) in funzione del volume di eluizione.
Il volume idrodinamico è ottenuto grazie alla viscosità intrinseca misurata dal detector di viscosità associato ad un detector di concentrazione e all’equazione:
MW • IV = 5/2 • NA • Vh
Per un campione ignoto, la curva di calibrazione ci consente di determinare il volume idrodinamico conoscendo il volume di eluizione (corrispondente al picco del detector di concentrazione), e poi con il valore della sua viscosità intrinseca misurata dal detector di viscosità si ottiene il peso molecolare.
La viscosità intrinseca corrisponde all’inverso della densità e costituisce un parametro diretto e sensibile per la caratterizzazione della struttura dei polimeri. In effetti, i noti diagrammi di Mark-Houwink che rappresentano IV = K • MWa danno accesso al branching e alla rigidità dei polimeri e sono ottenuti grazie al detector di viscosità.
