Sebbene le nanoparticelle (NPs) siano state utilizzate per la somministrazione di farmaci fin dagli anni ’90, i recenti progressi nel campo delle nanotecnologie hanno permesso ai ricercatori di sviluppare nuove strutture con proprietà notevolmente migliorate. Le nanoparticelle giocano oggi un ruolo sempre più importante nel trattamento del cancro, nella terapia genica e nel trattamento delle malattie neurodegenerative. Un veicolo efficace per la somministrazione di farmaci deve essere biocompatibile e non tossico, deve fornire una migliore solubilità e biodisponibilità del farmaco, deve proteggere e trasportare il farmaco al sito bersaglio (cellula o tessuto) e deve garantire il rilascio controllato del farmaco a destinazione.^1-2

Per caratterizzare le NPs vengono comunemente utilizzate diverse tecniche analitiche, tra cui lo scattering dinamico di luce (DLS), la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), la microscopia elettronica criogenica (crio-EM) e la microscopia ottica. La DLS può fornire una distribuzione delle dimensioni, ma poiché presuppone che le NP abbiano una struttura sferica, non può distinguere tra diverse morfologie. La TEM e la crio-EM sono microscopie elettroniche che operano in un ambiente non nativo e in genere richiedono l’applicazione di un rivestimento conduttivo al campione. Questo limita il tipo di campioni e di ambienti che possono essere esplorati. Infine, la microscopia ottica non può fornire una risoluzione sufficiente se le dimensioni delle particelle sono inferiori al limite di diffrazione della luce. La microscopia a forza atomica (AFM) aggira molte di queste limitazioni e fornisce ulteriori capacità di misurazione per caratterizzare in modo più completo le NPs. L’AFM può determinare con precisione la morfologia e la distribuzione dimensionale dell’intera popolazione di NPs in ambiente acquoso. Può inoltre misurare le proprietà nanomeccaniche delle NP, che possono essere utilizzate per ottimizzare ulteriormente la loro composizione e formulazione. Infine, grazie alla migliore risoluzione temporale dell’AFM ad alta velocità, è possibile determinare i tassi di dissoluzione e i meccanismi di degradazione delle nanoparticelle a rapida dissoluzione.

Le nanoparticelle per la somministrazione di farmaci sono classificate in base alla loro composizione: nanoparticelle lipidiche (LNP) e nanoparticelle polimeriche (PNP). Queste due categorie possono essere ulteriormente suddivise in base alla disposizione dei lipidi e al contenuto del nucleo. Ogni tipo di struttura ha i suoi vantaggi e le sue applicazioni appropriate. In questa relazione ci concentreremo sui liposomi e sulle nanoparticelle amorfe.

Studio della morfologia di liposomi

I liposomi possono essere personalizzati per ottenere un’interazione ottimale con il loro bersaglio, rendendoli veicoli altamente versatili per la somministrazione di farmaci. Poiché contengono regioni sia idrofobiche che idrofiliche, possono essere progettati per trasportare farmaci idrofili e lipofili rispettivamente nel core acquoso o nel doppio strato lipidico. I liposomi hanno un’efficacia terapeutica superiore grazie alla loro eccellente biocompatibilità, alla minima tossicità, alla stabilità e al migliore assorbimento. Per ottimizzarne le prestazioni, è fondamentale caratterizzare le loro dimensioni e la loro morfologia.^1,3

Figura 1: Topografia e forma di liposomi Doxyl in funzione del contenuto di farmaco incorporato: (a) 0%, (b) 20%, (c) 30% e (d) 40%. Scansione di 2 µm. Gli istogrammi della distribuzione granulometrica DLS per (a) e (d) sono mostrati negli inserti. (e) Immagini e vignette dei singoli liposomi per ciascuna forma.

La doxorubicina (DOX) è uno dei farmaci chemioterapici più potenti. Agisce inibendo la sintesi del DNA e innescando la produzione di radicali liberi nel sito del tumore. Per determinare la distribuzione dimensionale e la forma dei liposomi, i liposomi incapsulati con Doxorubicina (DOX) nella loro fase acquosa sono stati analizzati con AFM in funzione dell’inclusione di DOX (carico di farmaco). I dati AFM rivelano un aumento della diversità di forma all’aumentare della quantità di farmaco incorporato, anche se la dimensione media delle particelle determinata mediante DLS (Figura 1a,d inset) è rimasta costante a circa 100 nm, con un intervallo compreso tra 50 e 200 nm. Fino al 10% di DOX, i liposomi risultano sferici (Figura 1a). Tuttavia, con l’aumento del carico di farmaco, i liposomi diventano sempre più allungati, formando strutture prolate o oblate, come mostrato nella Figura 1b-d. Al carico più elevato, pari al 30-40%, è stata riscontrata anche una maggiore proporzione di liposomi con il centro depresso. Questi cambiamenti strutturali sono una conseguenza della disposizione del farmaco all’interno dei liposomi. Il DOX forma lunghe fibre che diventano sempre più allungate a concentrazioni più elevate, fino a piegarsi a formare fasci curvi.^4-5

Nanomeccanica di formulazioni di nanoparticlle amorfe

Le formulazioni di nanoparticelle amorfe sono sistemi relativamente recenti per la somministrazione di farmaci, ma stanno guadagnando interesse grazie alla loro capacità di migliorare sia la solubilità che la biodisponibilità di farmaci poco solubili. Il loro principale svantaggio è che sono termodinamicamente instabili e preferiscono trovarsi nello stato cristallino, più stabile. Il tempo di cristallizzazione può variare ed esistono opzioni per prevenire o rallentare questo processo, ma sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere appieno i meccanismi coinvolti.^6-8

L’AFM è stata utilizzata per studiare le proprietà nanomeccaniche delle nanoparticelle amorfe di Probucol (PBC) ricoperte dal polimero idrosolubile Hypromellose (HPMC). Le curve forza-distanza (indentazione) sono state utilizzate per distinguere gli stati amorfo, semicristallino e completamente cristallino delle NP in funzione del tempo. Spingendo la sonda AFM sulla superficie delle NP e monitorando la deflessione del cantilever, è possibile determinare la rigidità delle NP. Nella Figura 2, si notano le differenze nelle curve forza-distanza tra le NP amorfe più morbide, piccole e “giovani” (a), le NP semicristalline più rigide, più grandi e “vecchie” (b, c) e le NP cristalline molto rigide, più grandi e “vecchie” (d).7 Per confronto, è stata effettuata una misurazione forza-distanza anche sul substrato (Figura 2S).

Figura 2: Curve forza-distanza per campioni di NP a: (a) 0-1 giorno, (b) 2 giorni, (c) 4 giorni e (d) 7 giorni. La curva (S) è stata acquisita sul substrato non funzionalizzato.

Nella Figura 2, la pendenza delle curve (a) e (b) inizialmente bassa indica un campione conforme, ma mostra un brusco aumento rispettivamente a -17 nm e -40 nm di profondità di indentazione. Questo comportamento può essere attribuito agli effetti del substrato, che sono evidenti con le singole NP o i piccoli cluster, ma diminuiscono con l’età, l’aumento delle dimensioni delle particelle e la rigidità. La Tabella 1 confronta l’età, le dimensioni delle particelle, lo stato delle NP e include le strutture proposte per ciascun caso.

Tabella 1: Dimensioni, stato e struttura proposta dei campioni di NP PBC rivestiti di polimero amorfo in funzione del tempo (0-7 giorni).

Dissoluzione di nanoparticelle polimeriche amorfe

Oltre a migliorare la solubilità dei farmaci scarsamente solubili, le nanoparticelle polimeriche sono nanocarrier reattivi all’ambiente, in grado di rilasciare il farmaco incorporato in risposta a variazioni della composizione del tampone, del pH o della temperatura. In particolare, il pH è uno stimolo ideale poiché le vescicole per l’internalizzazione delle cellule e i tumori tendono ad avere un pH più basso.⁹ Tuttavia, le PNP tendono a dissolversi rapidamente, rendendo difficile misurare i loro tassi di dissoluzione con i metodi convenzionali.¹⁰

L’AFM ad alta velocità è uno strumento potente che ci permette di osservare e catturare i cambiamenti nella morfologia delle NP polimeriche, nonché l’eventuale dissoluzione e rilascio del farmaco incapsulato. La Figura 3 consiste in una serie di immagini acquisite in liquido a 1 fotogramma al secondo (FPS). Le NP di Eudragit® E (EUD-E) con acido mefenamico incapsulato (MFA, farmaco modello) sono state progettate per dissolversi in soluzioni acide a pH 5. Entro tre secondi, le NPs hanno iniziato a diminuire di dimensioni e sono scomparse completamente dopo cinque secondi. Questo esperimento sottolinea l’importanza di valutare il processo di dissoluzione in ambienti rilevanti (temperatura, pH, tampone) “in vivo” per valutare la qualità delle nanoparticelle e l’accuratezza della dissoluzione per garantire che il farmaco raggiunga il sito target prima del rilascio.

Figura 3: Dissoluzione di nanoparticelle polimeriche a pH 5 dopo esposizione per a) 0 s, b) 1 s, c) 2 s, d) 3 s, e) 5 s e f) 6 acquisite con Cypher VRS1250. 4 scansioni da 2 µm.

Conclusioni

L’AFM è uno strumento potente per caratterizzare la morfologia e le proprietà nanomeccaniche di nanoparticelle lipidiche e polimeriche in un ambiente nativo e in liquido. Inoltre, l’AFM ad alta velocità migliora la comprensione delle NP ad azione rapida, rivelando le dinamiche di dissoluzione in tempo reale. I risultati di questo tipo di studi possono essere utilizzati nell’ottimizzazione dei processi per migliorare le ricette di nanoformulazione e l’efficacia delle NP.

Referenze bibliografiche

1. Lu, S. Zhang, J. Wang, and Q. Chen, Frontiers in Nutrition 8, 783831 (2021).
2. Lipid Nanoparticle https://ascendiapharma. com/technologies/lipidsol/
3. Liu, G. Chen, and J. Zhang, Molecules 27 (4), 1372 (2022).
4. Takahashi, K. Ueda, K. Higashi, K. Yamamoto, and K. Moribe, Asian Journal of Pharmaceutical Sciences 11, 60 (2016).
5. Takahashi, K. Higashi, K. Ueda, K, Yamamoto, and K. Moribe, Journal of Pharmaceutical Sciences, 107 (2), 717 (2018).
6. Jog and D.J. Burgess, Journal of Pharmaceutical Sciences, 106, 39 (2017).
7. Egami, K. Higashi, K. Yamamoto, and K. Moribe, Molecular Pharmaceutics, 12 (8), 2972 (2015).
8. B. Nair, N. Sreeharsha, B.E. Al-Dhubiab, J.G. Hiremath, Shinu, M. Attimarad, K.N. Venugopala, and M. Mutahar, Materials, 12 (24), 4239 (2019).
9. Deirram, C. Zhang, S.S. Kermaniyan, A.P. Johnston, and G.K. Such, Macromolecular rapid communications, 40 (10), p.1800917 (2019).
10. Ueda, H. Sugasawa, K. Higashi, and K. Moribe, Journal of Pharmaceutical Machinery and Engineering, 32 (3), (2023).