Identificazione e quantificazione di particelle sub-visibili e non: API, contaminanti, polimorfi… con la tecnica MDRS^®

Lo studio di miscele farmaceutiche rimane da sempre una sfida di grande interesse. Dal polimorfismo intrinseco ai prodotti finali composti da sempre più ingredienti, le richieste analitiche si sono moltiplicate sia in numero che in complessità. Le attuali tecniche di riferimento spesso non sono in grado di fornire nello stesso tempo la separazione e l’identificazione dei componenti, poiché sono dedicate alla determinazione della chimica (spettroscopia) o delle caratteristiche delle singole particelle (microscopia ottica e SEM). L’integrazione in uno stesso strumento di tecniche in grado di analizzare particelle micrometriche con un’assoluta specificità chimica offre una nuova soluzione per descrivere accuratamente miscele farmaceutiche complesse, nel competitivo mercato di oggi.

MDRS^®: tecniche di microscopia e spettroscopia integrate

Per rispondere alla necessità d’identificazione e quantificazione di particelle visibili e sub-visibili la Malvern Panalytical propone la tecnica MDRS^® ‘Morphologically-Directed Raman Spectroscopy’: una tecnologia esclusiva che integra la microscopia ottica alla spettroscopia Raman con un software che automatizza l’analisi Raman su gruppi di particelle separate da criteri di dimensione e morfologia. La misura può essere effettuata sia su polveri che su dispersioni liquide, perché a contrario della FT-IR, la spettroscopia Raman non è sensibile alla presenza di acqua. La tecnica non ha il throughput di altre tecniche d’analisi per particelle sub-visibili, come la Flow Imaging Microscopy, ma rispetto a queste offre il vantaggio dell’identificazione chimica, fondamentale per discriminare particelle con stessa morfologia, e difficili da classificare con altri metodi. Nelle soluzioni parenterali ad esempio, alcuni eccipienti come il polisorbato possono degradarsi e formare particelle insolubili che si presentano con la stessa forma e trasparenza di particelle proteiche.
La tecnica MDRS^® consente la corretta identificazione e discriminazione di materiali con strutture complesse, come particelle di olio di silicone con proteine oppure di olio di silicone con tensioattivo.

Maggiori dettagli sulla tecnica MDRS^®

Deformulazione / reverse engineering per lo sviluppo di farmaci generici

La Tecnica MDRS^® consente di valutare le similarità tra 2 farmaci caratterizzando le particelle contenute in polveri, inalatori, compresse, emulsioni e sospensioni costituiti da un singolo o multipli API. L’associazione dell’immagine delle particelle all’identificazione Raman consente di confermare il profilo del prodotto in modo molto specifico.
Secondo la definizione stabilita dalla FDA (Food and Drug Administration), un farmaco generico è un prodotto paragonabile ad un farmaco di riferimento (Reference Listed Drug RLD) nel dosaggio, la forza, la modalità di somministrazione, la qualità, le prestazioni e l’uso previsto. Essere i primi sul mercato è uno dei principi fondamentali nel business dei generici e per questo molte aziende competono per creare generici di farmaci che vanno fuori brevetto. Le società farmaceutiche usano comunemente tecniche di deformulazione o reverse engineering, tuttavia, l’argomento e gli strumenti necessari sono raramente discussi e di pubblico dominio.

Case study

Due formulazioni di un trattamento dell’influenza/raffreddore sotto forma di polvere secca sono state analizzate con il Morphologi^® ID della Malvern Panalytical: un marchio commerciale e il suo generico. Le singole componenti all’interno delle formulazioni sono state identificate confrontando i loro spettri Raman con quelli di un database commerciale (libreria). Una volta identificati le componenti, sono state confrontate sia la composizione complessiva delle due formulazioni che la distribuzione granulometrica delle particelle delle singole componenti di ciascuna formulazione.
Sono stati registrati gli spettri Raman di migliaia di particelle per ciascun campione durante un’analisi overnight (10 secondi a particella).
La Figura 1 rappresenta la sovrapposizione delle distribuzioni granulometriche delle particelle riferite al Diametro Equivalente Circolare (CED) in numero e in volume dei due medicinali. Il farmaco commerciale contiene più particelle nel campo 30-200 μm rispetto al farmaco generico. La distribuzione dimensionale in numero indica che il farmaco commerciale contiene anche più particelle fini, con dimensioni inferiori a 20 μm.

Figura 1: Sovrapposizione delle distribuzioni granulometriche delle particelle riferite al Diametro Equivalente Circolare (CED) in numero (alto) e in volume (basso). 

Entrambi i farmaci contro il raffreddore sono composti da più di dieci componenti, inclusi i due principi attivi farmaceutici (API) Paracetamolo e Fenilefrina. Una libreria di spettri Raman di riferimento è stata creata per ciascuno degli undici componenti attivi identificati nei campioni.
Basandosi sugli spettri Raman di riferimento, è possibile classificare le singole particelle in uno dei componenti della formulazione mediante un punteggio di correlazione. Un punteggio vicino a 1 indica una buona corrispondenza, mentre un punteggio vicino allo zero indica una scarsa corrispondenza. Una classificazione di ogni particella basata su questo punteggio di correlazione è stata effettuata per identificare la proporzione di ciascun componente presente nelle due formulazioni.
I risultati sono presentati nella figura 2. I tre componenti più comuni in entrambe le formulazioni sono i componenti 1, 2 e 11. Il prodotto commerciale contiene una proporzione più importante di componente 1 rispetto al prodotto generico, mentre è stato trovato che il prodotto generico contiene più componente 2.

Figure 2: classificazione dei risultati (in volume)

Undici diversi componenti chimici sono stati identificati e assegnati a singole classi: le classi più abbondanti in entrambe le formulazioni sono risultate essere saccarosio e paracetamolo. È stato evidenziato che la formulazione commerciale conteneva più paracetamolo in volume e presentava una distribuzione dimensionale delle particelle maggiore.
Anche se in quantità minima, l’aspartame è stato identificato in entrambe le formulazioni ed è stato evidenziato avere una forma delle particelle più allungata rispetto ad altri componenti, ovvero aghiforme. Inoltre la formulazione commerciale conteneva più zucchero naturale rispetto al prodotto generico.
La dimensione e la forma delle particelle influenzano il tempo necessario alla completa dissoluzione del farmaco. Queste proprietà influenzano anche le prestazioni della formulazione, inclusi la struttura/consistenza, l’aroma e il rilascio del principio attivo (API). E quindi, oltre a consentire la validazione dell’equivalenza rispetto al prodotto di riferimento, la dimensione e la morfologia sono proprietà che possono anche influire sulla qualità percepita dal paziente.

Risolvere le miscele polimorfiche più difficili con una sensibilità e una flessibilità ineguagliate

Le conversioni polimorfiche rappresentano tuttora un problema nell’industria farmaceutica. Le condizioni di processo, un improprio immagazzinamento o semplicemente il tempo possono causare la transizione da una forma stabile ed efficace della sostanza farmaceutica ad un analogo strutturale indesiderato. Pertanto, stabilire la presenza in un farmaco di più forme polimorfiche è di grande interesse per le case farmaceutiche produttrici sia di innovatori che di generici. La spettroscopia vibrazionale (IR, Raman), è ampiamente utilizzata come tecnica per stabilire la presenza di più forme polimorfiche in un prodotto. Sfortunatamente, le tecniche spettroscopiche bulk comunemente disponibili mancano della sensibilità necessaria per rilevare bassi livelli di contaminanti polimorfi che possono essere presenti nei prodotti finali. Inoltre, le tecniche bulk forniscono solamente una panoramica della sostanza presente nell’area del campione analizzata e non hanno la capacità di disperdere correttamente il campione per fornire una caratterizzazione specifica e statisticamente rappresentativa delle singole particelle.
La tecnica MDRS^® ‘Morphologically-Directed Raman Spectroscopy’ è sensibile alle singole forme polimorfiche di una sostanza e può essere utilizzata per studiare le singole particelle e aiutare a determinare la stabilità a lungo termine di un prodotto. Si possono stabilire correlazioni tra risultati morfologici e spettroscopici, in cui gruppi di particelle morfologicamente differenti condividono spettri Raman comuni e viceversa. La capacità della tecnologia MDRS^® di individuare particelle di morfologia distinta su cui effettuare l’indagine Raman fornisce una maggiore sensibilità alla tecnica, in quanto gli spettri di particelle che non siano di interesse non vengono registrati. Allo stesso modo, una volta stabilito che un gruppo di particelle con spettri Raman simili può essere descritto da una morfologia comune, l’analista può determinare la quantità di particolato di un certo tipo senza la necessità di misurare uno spettro Raman per ogni particella nel gruppo morfologicamente simile. Questa correlazione tra morfologia delle particelle e identità chimica consente alla MDRS^® di migliorare significativamente l’efficacia rispetto ai metodi manuali.

Case study

Una miscela polimorfica di farmaci antidolorifici comuni è stata studiata utilizzando lo strumento Morphologi^® ID della Malvern Panalytical per caratterizzare dimensione, forma e identità chimica delle particelle. Oltre 70.000 singole particelle sono state rilevate per una miscela di paracetamolo in proporzioni 9 (Tipo I): 1 (Tipo II). Il campione era polidisperso, con alcune particelle rilevate oltre i 400 μm. Esempi delle particelle analizzate e la loro distribuzione granulometrica finale sono mostrati nella Figura 3.

Figura 3: Immagini di particelle rappresentative dalla miscela polimorfica di acetaminofene (sinistra) e la distribuzione granulometrica (ponderata in volume, destra).

La distribuzione granulometrica viene utilizzata per classificare le particelle in base alle loro dimensioni (da 10 μm a 25 μm, da 25 μm a 50 μm e superiori a 50 μm) per l’analisi Raman. Le particelle inferiori a 10 μm sono state escluse dall’analisi Raman.
La correlazione con la libreria di spettri Raman dei polimorfi puri ha rivelato 1220 particelle di tipo I e 144 particelle di tipo II, su 1375 particelle analizzate, corrispondente al 10,5% di polimorfismo di tipo II. Gli spettri Raman di riferimento ed esempi di spettri di particelle sono mostrati in figura 4. Lo studio di correlazione è stato limitato alle regioni dove le due specie sono facilmente distinguibili, ovvero da 1200 cm-1 a 1260 cm-1 e 1540 cm-1 a 1590 cm-1 (indicate dalle aree verdi in figura 4). Un punteggio di correlazione maggiore di 0,85 è stato richiesto per un’identificazione positiva come Tipo I o Tipo II. Per 11 particelle sono stati rivelati spettri corrispondenti a una miscela in quanto presentavano una correlazione con punteggio superiore a 0,85 con entrambi gli spettri di riferimento di Tipo I e Tipo II. Un esempio è anche mostrato in figura 4.

Figura 4: esempi di Spettri Raman raccolti da particelle di acetaminofene di tipo I (blu), acetaminofene di tipo II (rosso) e uno spettro di miscela Tipo I/Tipo II (nero). Gli spettri di Tipo I e di Tipo II sono sovrapposti agli spettri di riferimento usati per creare la libreria (punteggiata di nero). Le porzioni dello spettro in verde sono quelle utilizzate per la correlazione alla libreria di riferimento.

La corrispondenza tra gli spettri Raman misurati e quelli della libreria di riferimento è eccezionale e consente una facile discriminazione tra i due tipi di polimorfi entro i confini dell’analisi di correlazione. Gli spettri corrispondenti ad una miscela, identificati per un sottogruppo di particelle, sono probabilmente riconducibili alla formazione di aggregati durante la fase di preparazione della miscela polimorfica (vedere la nota applicativa per la metodologia).
La tecnologia MDRS^® offre chiari vantaggi rispetto ai metodi tradizionali di spettroscopia vibrazionale e si presta perfettamente alla caratterizzazione diretta di contaminazioni polimorfiche di basso livello. Gli spettri vengono raccolti per particelle singole, aumentando di almeno un ordine di grandezza la sensibilità di rivelazione della tecnica. Le caratteristiche morfologiche del particolato consentono inoltre di perfezionare ulteriormente la selettività del metodo. Se diverse forme polimorfiche presentano morfologie distinte, il metodo può essere modificato per indagare solo le particelle di particolare profilo morfologico. Questi punti di forza posizionano l’MDRS^® come una tecnica in grado di gestire le miscele polimorfiche più difficili con una sensibilità e una flessibilità senza precedenti, fornendo un nuovo strumento per l’analisi approfondita della qualità del prodotto, dallo sviluppo alla formulazione.